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Neue Laser-Mikroskopie-Methode liefert einzigartige Informationen für Arzneimittelforschung

Arzneimittelforschung

Der optisch gepumpte Halbleiterlaser ist eine ideale Lichtquelle für die strukturierte Beleuchtungsmikroskopie, eine Laserfluoreszenztechnik, die einzigartige Informationen für die Arzneimittelforschung liefern kann. Die Fluoreszenzmikroskopie mit Hilfe von Sonden und transgenen fluoreszierenden Proteinen ist ein grundlegendes Instrument, das in den gesamten Biowissenschaften und nicht nur in der Arzneimittelforschung eingesetzt wird. Um den Zusammenhang zwischen Ereignissen auf molekularer Ebene und makroskopischer Struktur und Dynamik besser zu verstehen, verwenden Forscher jetzt zunehmend eine wachsende Zahl so genannter Superauflösungsmikroskopie-Methoden, die die klassische Beugungsgrenze bei der räumlichen Auflösung überschreiten. Coherent unterstützt diese Methoden mit seiner Genesis-Serie von Multiwatt-Lasern. Leider ist die superauflösende Bildgebung oft zu langsam, um Prozesse wie Bindungen, Signalübertragung und andere Ereignisse in Echtzeit zu verfolgen. Außerdem kann die hohe Laserleistung, die erforderlich ist, in lebendem Gewebe ein Problem mit Photodestruktion darstellen. 

Die strukturierte Beleuchtungsmikroskopie (Structured Illumination Microscopy, SIM) ist eine Methode mit verbesserter Auflösung, die eine wesentlich höhere Geschwindigkeit über ein breites Sichtfeld bietet und dennoch die Beugungsgrenze überschreitet. SIM liefert eine typische laterale (xy) Auflösung von 100-120 nm. Sie kann in einem 3D-Format mit einer sehr effektiven Unterdrückung des Rauschens außerhalb des Fokus eingesetzt werden, was zu einer axialen Auflösung von <500 nm führt, was sie zu einem nützlichen Werkzeug für optische Schnitte macht. In der Arzneimittelforschung kann diese Auflösung wichtige Informationen darüber liefern, wie subzelluläre Komponenten beispielsweise unter dem Einfluss von Arzneimittelkandidaten reagieren und wie die Chemikalie in den Zellkern gelangt.

Laser-Mikroskopie nutzt Algorithmus für schnellere Ergebnisse

SIM ist eine Interferenztechnik, die sich die kohärenten Welleneigenschaften des Laserlichts zunutze macht. Im SIM-Mikroskop erzeugt eine Optik, ein so genanntes Beugungsgitter, ein Lichtmuster auf der Probe. Im ursprünglichen SIM-Format wurde ein einfaches Muster aus linearen Streifen verwendet. Die Kamera nimmt ein Rohbild auf, das eine Faltung des Beleuchtungsmusters und der räumlichen Details der Probe im Submikrometerbereich ist. Die Position und Ausrichtung der Streifen wird mehrmals geändert, und das emittierte Fluoreszenzmuster wird für jede dieser Positionen aufgezeichnet. Das Mikroskop verwendet dann einen Algorithmus, um aus diesen mehreren Rohbildern ein vollständiges Bild zu rekonstruieren. Eine neuere Variante namens Lattice SIM verwendet eine dreidimensionale Matrix aus Punkten statt Streifen und hat den Vorteil, dass eine geringere Anzahl von Teilbildern benötigt wird. Dies führt zu einer höheren Geschwindigkeit und einer geringeren Photonendosis, was beides wichtige Vorteile für die Verfolgung dynamischer Prozesse in lebenden Zellen sind.

Ein Vergleich einer Lattice SIM² Aufnahme mit einem konfokalen Bild. Das Bild zeigt 1. Auflösungsteigerung bei SIM² und 2. Besseres Sectioning bei SIM², Bild: Carl Zeiss Microscopy

Die SIM-Technik stellt eine Reihe von Anforderungen an die Laserlichtquelle selbst. Die Leistung hängt von der erforderlichen Abbildungsgeschwindigkeit und der Lichtempfindlichkeit der Probe ab. In der Regel liegt der optimale Laser jedoch bei 200-300 Milliwatt. Die Strahlqualität ist wichtig, wobei TEM00 der bevorzugte Modus ist, der einem perfekt kreisförmigen Strahl mit gaußförmigem Intensitätsquerschnitt entspricht. Dies maximiert die Auflösung der endgültigen Bilder und gewährleistet die effizienteste Nutzung der verfügbaren Laserleistung. Ein geringes Ausgangsrauschen des Lasers ist bei jeder Bildgebungsanwendung wünschenswert, aber besonders nützlich für SIM, das endgültige Bilder aus mehreren nacheinander aufgenommenen Teilbildern erzeugt. Und vor allem muss die Laserwellenlänge auf die Anregungseigenschaften der verwendeten fluoreszierenden Sonden und Proteine abgestimmt sein.

Autoren: Vielen Dank an Dr. Matthias Schulze und Petra Wallenta.

Kontakt:
Dr. Matthias Schulze
Coherent Inc.
E-Mail: matthias.schulze@coherent.com
www.coherent.com

Stichwörter
LaserCoherent