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Multi-Parameter-Durchfluss-Zytometrie unterstützt Forschung einschließlich Immunologie

Neue UV-Laserwellenlängen helfen bei der Überwachung des klinischen Fortschritts

Coherent Zytometrie

Multiparameter Messverfahren werden durch neue UV-Laser (349 nm und 360 nm) immer smarter - integrierte Lichtquellenmodule vereinfachen und beschleunigen die Entwicklung neuer Geräte. In einem Durchfluss-Zytometer strömt eine Anzahl von Zellen in zeitlicher Sequenz durch eine Messzone. Dabei passiert jede Zelle einen oder mehrere fokussierte Laserstrahlen, die durch Fluoreszenz und Streuung Signale erzeugen. Diese Signale werden in einer Serie von diskreten Wellenlängen-Kanälen durch Photomultiplier (PMTs) oder Avalanche–Photodioden (APDs) in Verbindung mit Wellenlängen-selektiver Optik wie dichroitische Strahlteiler und Bandpass- oder Kantenfilter analysiert.

In vielen Anwendungsbereichen in Klinik und Forschung werden die Zellen mit einem oder mehreren fluoreszenten Reagenzien (Fluorochrome) präpariert. Bei geeigneter Präparation kann eine große Anzahl von unterschiedlichen Zellen schnell auf Oberflächen- oder innere Eigenschaften untersucht werden. Eine besondere Stärke der Zytometrie ist die Multi-Parameter-Analyse. Hierbei korreliert ein Parameter mit einem spezifischen Fluorochrom, der Eigenfluoreszenz oder der Streuung unter einem spezifischen Winkel. Selbst mit nur einer Laserwellenlänge, (z.B. 488 nm) können mehrere Parameter analysiert werden. Dies ist möglich, da unterschiedliche Fluorochrome Strahlung bei 488 nm absorbieren, ihre Emissionsspektren jedoch verschieden sein können. Dabei registrieren die einzelnen Kanäle unterschiedliche Intensitäten.

Zytometrie: Durch die Verwendung von Lasern verschiedener Wellenlänge und mehreren Fluoreszenzkanälen kann ein einzelnes Instrument gleichzeitig mehrere Parameter analysieren

Wenn mehrere Laser-Wellenlängen gleichzeitig mit spezifischen Fluorochromen verwendet werden, wächst die Anzahl der zu analysierenden Parameter. Dadurch kann ein Multicolor-Zytometer mit 5 Laser-Wellenlängen und mehreren Wellenlängen-spezifischen Detektoren 25 oder mehr verschiedene Parameter gleichzeitig analysieren. Nach Optimierung einer Proben-Präparation gelingt mittels quantitativer Analyse von 20 unterschiedlichen Parametern die Identifikation vieler verschiedener Zelltypen mit hoher Spezifität.

Moderne Multi-Parameter-Durchfluss-Zytometer werden z.B. in der Immunologie, der Arzneimittelforschung und als wichtiges klinisches Diagnoseinstrument eingesetzt. Die Zahl der Anwendungen wächst kontinuierlich, neue Laser und komplexere Fluorochrome werden entwickelt. Aus der Sicht eines Laserherstellers sind die  Steigerung der zu messenden Parameter und die einfache Integration mehrerer Laserwellenlängen zur schnelleren Geräteentwicklung und Kostenreduktion wichtig.

Die Erweiterung des UV-Wellenlängenbereichs

Bestimmung der DNA mittels Durchflusszytometrie wird verbreitet ausgeführtIm Bereich der Wissenschaft wird durch eine hohe Zahl möglicher Parameter die Durchführung komplexer Experimente ermöglicht. In der klinischen Anwendung können viele der detaillierten Messdaten, z.B. zur Verbesserung der individualisierten Behandlung in der Onkologie, beitragen. Einige der heutigen Instrumente nutzen bereits 10 Laserwellenlängen im sichtbaren Spektralbereich. Ein innovatives Konzept war die Zusammenführung verschiedener Lasertechnologien in einer Plattform mit identischer Form und Anschlüssen, die eine „drop-in“-Funktionalität mit einer großen Anzahl von Laserwellenlängen ermöglicht. Coherent hat diese Entwicklung mit der OBIS®-Produktlinie ins Leben gerufen, welche die beste Technologie zur jeder speziellen Wellenlänge bereitstellt. Neben dem sichtbaren Spektrum ist der IR- und UV-Spektralbereich von großem Interesse. Zunehmend stehen kleine Laser mit geringer Abwärme, hoher Strahlstabilität und langer Lebensdauer zur Verfügung.

Die Situation hat sich mit der Entwicklung zweier neuer UV-Wellenlängen für die OBIS®-Laserbaureihe grundlegend geändert. Diese neuen OBIS® XT Laser haben Wellenlängen von 349 nm und 360 nm mit Ausgangsleistungen von 20, 60, oder 100 mW. Es handelt sich hierbei um diodengepumpte Festkörperlaser (DPSS-Laser) in frequenzverdoppelter Praseodymium-Technologie. In diesem Konzept ist keine Frequenzverdreifachung mehr erforderlich, was die Effizienz der Laser erhöht und die Abwärme verringert. Dadurch können diese Laser mit gleicher Zuverlässigkeit, Lebensdauer und Abmessungen wie die übrigen Laser der OBIS-Familie gefertigt werden, was eine einfache Integration von einzelnen Lasern oder den Aufbau von kompakten Multi-Laser OEM-Modulen ermöglicht.  Die neuen Laser der OBIS-Familie verfügen über das gleiche elektronische Interface und die gleiche Strahlcharakteristik wie die anderen OBIS-Laser: 0,7 mm TEM00, eine identische Spezifikation für Strahlstabilität, -symmetrie und andere Parameter. Diese kompakten UV-Laser versprechen auch Fortschritte in anderen Anwendungen, wie der konfokalen Mikroskopie und der Halbleiterinspektion.

Integrierte Lichtquellen vereinfachen die Entwicklung neuer Instrumente

Unübersehbar ist die wachsende Nachfrage nach Lichtquellen mit mehreren Wellenlängen für kompakte Instrumente. Ein Beispiel ist der CellX von Coherent, der mehrere OBIS Laser mit frei wählbaren Wellenlängen enthält – siehe Abb. 2. Hierbei sind alle Laser, die Elektronik, die Strahlformungs- und Fokussierungsoptik in einem Modul eingebaut, was die Entwicklung von Multi-Parameter Instrumenten sehr vereinfacht. Diese serienmäßigen Module werden derzeit mit den 4 meistgenutzten Wellenlängen für Multi-Parameter Instrumente ausgerüstet: 405, 488, 561 und 637 nm.  Jedoch sind alle Optiken – in Anbetracht der Marktanforderungen – bereits kompatibel mit den neuen UV-Wellenlängen. Zytometer nutzen diese Lichtquellen als eine Serie von Laserstrahlen mit elliptischem Fokus für hohe Zeitauflösung und große Toleranz der Zellposition beim Messvorgang.

Der OBIS CellX verfügt über variabel justierbare Ausgangsstrahlen. Eine genaue Einstellmöglichkeit für jeden der 4 Strahlen ermöglicht die Separation zwischen den versetzten Fokuslagen in einem Bereich von 0 (übereinanderliegend) bis ± 250 µm. Die Dimensionen der Ellipse in x- und y-Achse können für jede Wellenlänge justiert und Form, Lage und Position aller vier Laserstrahlen eingestellt werden. Über eine USB-Verbindung kann jeder Laser angesteuert werden. 

OBIS CellX bietet mehrere Vorteile. Der Instrumentenhersteller kann durch Outsourcing von Laserintegration und Strahlführung Entwicklungskosten sparen, verkürzt die Zeit zur Markteinführung und verfügt über erprobte Komponenten mit hoher Funktionssicherheit. Standardisierte Komponenten und Elektronik sparen Kosten – beispielsweise bei Verwendung nur eines Laser-Kontrollboards und gemeinsamer Stromversorgung. Outsourcing der Photonik-Technologie erlaubt mehr Zeit zur Optimierung der Chemie der Fluorochrome und anderer Geräteeigenschaften sowie neuer Analysemethoden und Messtechniken.

Zusammenfassung

Die Durchfluss-Zytometrie ist ein Feld mit dynamischer Entwicklung und die Anforderungen seitens Forschung und klinischer Anwendung wachsen stetig. Laserhersteller unterstützen diese Entwicklung mit neuen Lösungen für die nächste Gerätegeneration in der  individualisierten Medizin und Behandlungsmethoden der Zelltherapie.

Autor: Dr. Matthias Schulze, Coherent, matthias.schulze@coherent.com

Presse / Marketing: Petra Wallenta, petra.wallenta@coherent.com

Weitere Informationen erhalten Sie unter www.coherent.de.